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技术文章

A549细胞培养注意事项问题解答

点击次数:1825   发布时间:2016/12/9 18:41:53

 一、细胞培养基础问答

 

1.BHK细胞就是指BHK21吗?

    答:BHK细胞是指幼年叙利亚地鼠肾细胞(Baby Hamster Syrian Kidney),1961年建株。原始的细胞株是成纤维细胞,贴壁依赖性。1963年获得单细胞克隆细胞。后经无数次传代后细胞可悬浮生长,它广泛用于增殖各种病毒,生产兽用疫苗。*常用的是BHK21的一个亚克隆细胞,即克隆13或C13 。

2.二倍体细胞有什么特点?

   答:二倍体细胞的染色体组型是2n核型;贴壁依赖接触抑制;一般可传代50代;无致瘤性。如W1-38:正常胚肺组织人二倍体细胞系。MRC-5:从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。

3.什么是动物细胞大规模培养?

    答:所谓动物细胞大规模培养技术(large-scale culture technology)是指在人工条件下(设定pH、温度、溶氧等),在细胞生物反应器(bioreactor)中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、CHO(中华仓鼠卵巢)细胞、BHK-21、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞)等,并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。

    在过去几十年来,细胞培养技术经有了很大发展,从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube等贴壁细胞培养,发展为生物反应器(Bioreactor)进行大规模细胞培养。

4.细胞体内外培养的差别是什么?

    答:细胞离体后,失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响,生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中,日久天长,易发生如下变化:分化现象减弱;形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡;或发生转化获得不死性,变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此,培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体,它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能,也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后,这种差异就开始发生了。

5.什么是无血清培养基?与普通培养基有什么区别?

    答:无血清培养基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。添加组分可能包括纤连蛋白、层粘连蛋白等贴壁因子、胰岛素、转铁蛋白、硒等。

6.什么是无血清无动物组分培养基、无蛋白培养基和限定化学成分培养基?

    答:无血清无动物组分培养基是不含任何动物来源成份的无血清培养基,但可能添加植物蛋白或重组蛋白。无蛋白培养基(protein free midium,PFM):即不含有蛋白的培养基,无论是植物蛋白或动物蛋白。成分培养基(chemical defined medium,CDM):是指培养基中的素有成分都是明确的,它同样不含有蛋白,也不是添加了植物水解物,而是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物,如短肽等。这种培养基更有利于分析细胞的分泌产物和产品纯化。

7.HEPES在细胞培养过程中起什么作用?

    答:HEPES溶液:是一种弱酸,中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸,主要作用是防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下,观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境,CO2气体迅速逸出,pH迅速升高,若加了HEPES,此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES。

8.CO2 培养箱之水盘如何保持清洁?

答:定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。

二、 培养基生产和使用常见问题

1.低血清培养基能用肉眼判断其pH值吗?

   答:低血清培养基中酚红的含量与普通培养基中的酚红含量不同,不能通过肉眼观察或通过经验来判定pH值,建议使用pH计进行测定。

2.低血清培养基的缓冲系统是什么?

   答:平衡盐一般是由无机盐及葡萄糖组成的。平衡盐有Hanks′系统、Earle′s系统、Dulbecco′s磷酸缓冲盐系统等。199系列培养基、MEM系列培养基均有Hanks′系统的培养基及Earle′s系统的培养基。但是有些培养基均不是以上常规的平衡盐系统,例如RPMI 1640培养基、F12培养基。MEM(SLM)低血清培养基的平衡盐系统也不是常规的平衡盐系统,该平衡盐系统的缓冲能力强于常规平衡盐系统的缓冲能力。

3.谷氨酰胺溶液和碳酸氢钠的配制方法是什么?

   答:以0.2mol/L的 L-谷氨酰胺配制为例:称取L-谷氨酰胺2.92g,加注射用水100ml,充分搅拌混匀。用0.2μm滤膜正压过滤除菌。溶液应在4℃下避光保存,2周内使用。以7.5% NaHCO3的配制为例:称取NaHCO37.5g溶于100ml蒸馏水中过滤除菌。

4.什么培养基中可以省去加酚红?

   答:酚红在培养基中用作pH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。酚红本身对生物制品质量并不会产生影响,可以通过纯化技术去除,但酚红在无血清培养基可能带来胞内钠/钾失衡,影响细胞生长,当然这种作用能被血清所中和或减轻。酚红并不是培养基中必需的一种成分,很多国外的疫苗或抗体生产企业在生产过程中都使用无酚红培养基。

5.放置在冰箱中的培养基颜色会发生变化,为什么?

 

     答:培养基保存于4℃冰箱中,培养基内CO2 会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性。而培养基中酸碱指示剂(通常为phenol red)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱后再用于细胞培养将造成细胞生长停滞或死亡。培养基偏碱时,可以通入无菌过滤的CO2,以调整pH值。

6.无血清培养与有血清培养使用的抗生素量一样吗?

    答:当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。因为血清中的蛋白会结合和灭活一些抗生素。而在无血清培养条件下,抗生素不被灭活。

7.培养基中添加了血清和抗生素后,可长期保存吗?

    答:一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

8.什么是个性化培养基?它有什么优点?

    答:根据细胞类型、培养方式和生产工艺等特点所定制的培养基,即个性化培养基。个性化培养基在国外生物制药企业被普遍采用,个性化培养基可以为细胞生长提供充足的营养物质,能提高细胞的生长速率、培养密度、以及延长细胞维持时间;也可以为细胞生长提供均衡的营养供给,减少细胞有害代谢物质的积累,降低对细胞生长的危害;同时对贴壁细胞而言,能增加细胞的贴壁性,并降低培养过程中剪切力对细胞的损伤;个性化培养基可以根据各户的特殊需求减少或不使用动物源成分,从而使生物制品安全性更有保障。

9.细胞培养基偶然被冻,可否继续使用?

    答:如果细胞培养基偶然被冻,您应该自然溶解培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生,培养基可以正常使用,如果出现沉淀,只能丢弃这些培养基。

10.细胞冷冻培养基之成份为何?

    答:动物细胞冷冻保存时*常使用的冷冻培养基是含5 - 10%DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95%原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合。注意:由于DMSO稀释时会放出大量热能,故不可将DMSO直接加入细胞液中,必须使用前先行配制完成。

11.培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗?

    答:大部分添加物和试剂*多可以冻融3次,如果次数过多会将使含有的蛋发生降解和沉淀,这将会影响它的性能。

12.液体培养基的保存是冷藏好?还是冷冻好?

    答:要冷藏!!通常液体培养基在冷藏条件下可存放6个月到一年。

三、常见血清使用问题

1.血清使用时一定需要灭活么?

答:实验显示,经过正确处理的热灭活血清对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至因为高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察,像是“小黑点”,常常会让研究者误以为是血清遭受污染,而把血清放在37℃环境中,又会使此沉淀物更增多,使研究者误认为是微生物的分裂扩增。若非必须,可以不需要做热处理这一步。不但节省时间,更确保血清的质量。

 

2.何谓FBS, FCS, CS, HS?

答:FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 两者都是指胎牛血清, FCS 乃错误的使用字眼, 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

3.保存血清*的方法是什么?

答:我们建议血清应保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃时,请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶,建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内,再放回冷冻。

 

4.如何解冻血清才不会使产品质量受损?

 

答:将血清从冷冻箱取出后,先置于2~8℃冰箱使之融解,然后在室温下使之全融。但必须注意的是,融解过程中必须规则地摇晃均匀。

 

 

5.血清解冻后发现有絮状沉淀物出现,该如何处理?

    答:血清中沉淀物的出现有许多种原因,但*普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成,而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白)在血清解冻后,也会存在于血清中,亦是造成沉淀物的原因。但这些絮状沉淀物,并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物,可以将血清分装至无菌离心管内,以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。*不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物,因为它可能会阻塞过滤膜。

6.如何避免血清中沉淀物的产生?

    答: (1)解冻血清时,请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温),若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃),非常容易产生沉淀物。

        (2)解冻血清时,请随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。

        (3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定的成分会因此受到损害,而影响血清的质量。

        (4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以无须做此步骤。

        (5)若必须做血清的热灭活,请遵守56℃,30分钟的原则,并且随时摇晃均匀。温度过高,时间过久或摇晃不均匀,都会造成沉淀物的增多。

四、细胞培养常用试剂使用问答

1.谷氨酰胺使用方法是什么?

    答:谷氨酰胺在溶液中很不稳定,故4℃下放置1周可分解50%,使用中*单独配制,置-20℃冰箱中保存,用前加入培养液中。

2.碳酸氢钠在室温条件存放是否稳定?

答:碳酸氢钠白色粉末,或不透明单斜晶系细微结晶。比重2.159。无臭、味咸,可溶于水,微溶于乙醇。其水溶液因水解而呈微碱性,受热易分解,在65℃以上迅速分解,在270℃时完全失去二氧化碳,在干燥空气中无变化,在潮湿空气中缓慢分解。

3.培养细胞生长减慢的原因有哪些?其解决办法有哪些?

    答:可能得原因有:更换了不同的培养液或血清;培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子等耗尽或缺乏或已被破坏;培养物中有少量细菌或真菌污染;试剂保存不当;比较新培养液与原培养液成分,比较新血清与旧血清支持细胞生长实验找出可能的原因。

        解决办法:增加起始培养细胞浓度;让细胞逐渐适应新培养液;换入新鲜配制培养液;补加谷氨酰胺或生长因子等;用无抗生素培养液培养,如发现污染,丢弃培养物,或用抗生素除菌;血清需保存在-5℃到-20℃;培养液需在2-8℃避光保存;含血清完全培养液在2-8℃保存,并在2 周内用完;分离培养物,检测支原体。

4.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?

    答:L-谷氨酰胺在细胞培养时非常重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,降解率随保存温度而变。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。

5.细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好吗?

    答:不见得!因为胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca++, Mg++离子和血清等因素有关。通常情况下,pH 8.0 , 温度 37 oC 其作用能力*强。另外,钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。我们每次进行传代消化前,一定要用D-Hanks液或PBS液反复冲洗细胞培养瓶,以便于将含血清的培养基冲洗干净,这样就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液浓度为:

     (1)0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA;

     (2)0.25% 胰蛋白酶

     多数细胞传代消化可使用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA这种消化液。

6.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么?

    答:二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。

7.GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?

    答:GlutaMAX-I 即谷丙氨酸二肽,是一个L-谷氨酰胺的衍生物,其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分钟,GlutaMAX-I 二肽溶液有*小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解

8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么?

    答:丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源,尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。

9.Hank′s 平衡盐溶液(HBS)和Earle′s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?

    答:HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagle′s (2.2g/L)中比在Hanks′ (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。Eagle′s液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hanks′液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagle′s液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks′液就可以了。

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