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细胞培养用液的配制与消毒

点击次数:927   发布时间:2016/11/7 20:44:37

 细胞培养用液的配制与消毒

  器材与试剂:

  干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。

  具体步骤:

  一. 水的制备:

  细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水

  二.PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS,如:Hanks,D-Hanks液的配制):

  1.溶解定容:将药品(NaCl 8.0g,KCl 0.2g,Na2HPO4•H2O 1.56g,KH2PO4 0. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液。

  2.移入溶液瓶内待消毒:将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。

  三. 胰蛋白酶溶液的配制与消毒:

  胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在pH为8.0、温度为37℃时,胰酶溶液的作用能力*强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS,如:D-Hanks液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

  1.称取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液浓度为0.25%,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。搅拌混匀,置于4℃内过夜。

  2.用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。

  四.青、链霉素溶液的配制于消毒

  1. 所用纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。

  2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌双蒸水,即每毫升各为20万单位。

  3.使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度*终为100单位/ml。1单位=1微克?

  五.RPMI1640的制备与消毒:

  1.溶解、调PH值、定容:先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度*终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。*后定容至1000ml,摇匀。

  2.安装蔡式滤器:安装时先装好支架,按规定放好滤膜,用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。

  3.抽滤:配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。

  4.分装:将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。

  5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4℃时两周有效)。

  六.血清的灭火:

  细胞培养常用的是小牛血清,新买来的血清要在56℃水浴中灭火30分钟后,再经过抽滤方可加入培养基中使用。

  七.HEPES溶液:

  HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid )。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L,一般培养液内含20mmol /LHEPES即可达到缓冲能力。

  1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下:

  准确称取HEPTS 238.3g,加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌,分装后4℃保存。

  注意:因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶,所以可根据实际情况灵活配制,但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如:称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中,过滤除菌后可完全(20ml)加入1L培养液中,或者每100ml培养液中加入2ml即可。

  八.谷氨酰胺:

  合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4℃下放置1周可分解50%,故应单独配制,置于-20℃冰箱中保存,用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时,应重新加入原来的谷氨酰胺。

  一般培养液中谷氨酰胺的含量为1~4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存,用时加入培养液。配制方法为,谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液,充分搅拌溶解后,过滤除菌,分装小瓶,-20℃保存,使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。

  九.肝素溶液的配制:

  含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高,肝素加入全培养液中*终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠,包装为约为0.56克/瓶,配制时,可将其溶于100ml三蒸水中,定容,过夜,然后过滤除菌,分装小瓶,保存温度为¬¬ ℃ 。使用时,向100ml培养液中加入1ml(精确可加入0.9ml)即可。

  十. Ⅰ型胶原酶:

  0.1%Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意:因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大,不容易过滤,因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。

  十一.明胶溶液:

  因为明胶难于过滤,所以配制0.1%明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克(配成100ml溶液)—即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液,明胶也难溶,因此要充分摇匀,过夜放置,然后无菌分装入50ml小瓶中,4℃保存。

  其他培养用液的配制:

  20ug/ml内皮生长因子,

  注意事项:

  1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。

  2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米 和0.22微米滤膜各一张,放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方,并且要特别注意滤膜光面朝上。

  3.配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清,而小牛血清略偏酸性,为了保证培养液PH值*终为7.2,可在配制时调PH至7.4。

  细胞传代培养(消化法)

  具体操作:

  一. 传代前准备:

  1.预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

  2.用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。

  3.正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。

  4.点燃酒精灯:注意火焰不能太小。

  5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶,放入微波炉内高火,8分钟再次消毒。

  6.取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

  7.从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。

  8.打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。

  二.胰蛋白酶消化;

  1.加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞*,*佳消化温度是37℃。

  2. 显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。

  3.吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。

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